کنترل کیفی و کالیبراسیون میکروپیپت

کنترل کیفی و کالیبراسیون میکروپپیت می تواند تاثیر زیادی را بر صحت و دقت آن داشته باشد. کنترل کیفی میکروپیپت ها باید سالانه انجام شده تا کالیبراسیون آنها و در نتیجه عملکرد صحیح آنها حفظ شود. اما در این فاصله، توصیه می‌شود که برای تست عملکرد میکروپیپت‌، خودتان بررسی معمولی و سریعی انجام دهید تا در طول تست های آزمایشگاهی مهم خود از صحت نتایج مطمئن باشید. از آنجایی که صحت و دقت میکروپیپت، تأثیر مستقیمی را بر کیفیت نتایج دارد، ضروری است که عملکرد میکروپیپت ها از نظر کیفی بصورت جداگانه و به طور منظم کنترل شده و با مشخصات سازنده مقایسه شود. آنالیز وزنی یک روش کاربردی و متداول برای کنترل کیفی (صحت و دقت) میکروپیپت است.

نکته: در صورتیکه که از میکروپیپت های الکترونیکی استفاده می کنید، هشدار یادآور کالیبراسیون را در دوره های زمانی مشخص می توان تنظیم کرد.

شرایط محیطی و تجهیزات لازم برای کنترل به روش وزن سنجی

روش وزن سنجی توسط سازمان های استاندارد بین المللی (ISO 8655) توصیه شده است. این روش بر اساس تعیین وزن نمونه های آب ریخته شده توسط میکروپیپت است. اجرای این روش مستلزم نظارت دقیق بر شرایط محیطی و استفاده سیستماتیک از تجهیزات کافی و کنترل شده می باشد.

محیط

محیط باید عاری از گرد و غبار بود و دمای ثابت بین 15 تا 30 (5±) درجه سانتی گراد را در طول وزن سنجی ها داشته باشد.

مواد و تجهیزات لازم:

ترازو

برای  وزن سنجی از ترازوی آنالیتیکال باید استفاده شود. با ترازهای آنالیتیکال مدرن، تنها به دو ترازو نیاز است تا انواع میکروپیپت‌ها از حجم 0.1 میکرولیتر تا 10 میلی‌لیتر را وزن گیری کرد. یک مجموعه خوب شامل یک ترازوی شش رقم و یک ترازوی دیگر است که در دو مقیاس کار می کند، به عنوان مثال ترازوی 50 گرم با حساسیت 0.01 میلی گرم و 200 گرم با حساسیت 0.1 میلی گرم. ترازوها باید توسط دپارتمان ملی توزین و اندازه گیری کالیبره، نگهداری و تایید شوند. برای به حداقل رساندن ارتعاش، ترازو باید روی میز توزین قرار گیرد. ترازو باید مجهز به حفاظ مناسب باشد تا از ورود گرد و غبار و تبخیر آب جلوگیری کند. در صورت امکان از ابزار تله بخار برای به حداقل رساندن تاثیرات تبخیر استفاده کنید. در صورت عدم دسترسی به این وسیله به روش زیر، چهار ظرف محتوی آب را در 4 گوشه داخلی محفظه ترازو قرار دهید. 

1. دقت ترازوی مورد استفاده توسط حجم اسمی میکروپیپت و بصورت زیر تعیین می شود:

حجم	دقت ترازو
1µl ≤ V ≤ 10 µl	(0.001 mg) 6
10µl < V ≤ 100 µl	(0.01 mg) 5
100µl<	(0.1 mg) 4

ظرف توزین

برای به حداقل رساندن تجمع بارهای ساکن، ترجیحاً از یک ظرف فلزی استفاده کنید.

جایگزین: لوله میکرو سانتریفیوژ 1.5 میلی لیتری

مایع مورد تست

از آب مقطر یا آب دیونیزه شده مطابق با درجه 3 استاندارد  ISO 3696، گاز زدایی شده یا متعادل شده با هوا استفاده کنید. دمای آب باید دمای اتاق باشد.

سرسمپلر

برای کسب بهترین نتیجه کالیبراسیون از سرسمپلرهای استاندارد و یا سرسمپلرهای توصیه شده توسط شرکت سازنده میکروپیپت استفاده کنید. سرسمپلرهای استاندارد، بصورت محکم به میکروپیپت متصل شده و نشت نمی کند. در نتیجه باعث کسب درست ترین نتایج می شود.

.

2. قبل از شروع وزن سنجی

میکروپیپت، سرسمپلر و آب دیونیزه را 2 ساعت قبل از شروع اندازه گیری در اتاق آزمایش قرار دهید تا با شرایط اتاق به تعادل برسد. تاریخ، دمای محیط و فشار هوا را یادداشت کنید. اگر به فشارسنج دسترسی ندارید، فشار اتمسفر ثبت شده ایستگاه هواشناسی محلی خود را در ایننرنت جستجو کرده و از آن استفاده کنید.

دقت کنید که برای کسب بهترین نتایج، باید با تکنیک های صحیح پیپتینگ بصورت کامل آشنا باشید.

 3. تست نشت

قبل از انجام وزن سنجی، بررسی کنید که آیا میکروپیپت شما نشتی دارد یا خیر. به این منظور:

1. سرسمپلر را با آسپیراسیون و توزیع حجم اسمی مورد نظر، 3 بار مرطوب کنید.
2. با استفاده از همان سرسمپلر، حجم اسمی را آسپیره کنید.
3. در حالی که سرسمپلر ، 2 میلی متر در مایع غوطه ور شده است، میکروپیپت را به مدت 30 ثانیه به صورت عمودی نگه دارید.
4. اگر سطح مایع کاهش نیافت، اعتبارسنجی را ادامه دهید. کاهش سطح مایع نشان دهنده نشتی است.

4. وزن سنجی

ظرف توزین نباید خشک باشد. مقداری آب مقطر به آن اضافه کنید.

تعداد وزن سنجی ها

حداقل باید 4 اندازه گیری را در 100% و در 10% حجم اسمی انجام دهید. از 100% شروع کنید.

در میکرو پیپت های چند کاناله، کانال اول و وسط را اعتبار سنجی کنید.

 روش وزن سنجی

• ظرف توزین را روی ترازو قرار دهید و آن را صفر کنید.
• یک سرسمپلر جدید بردارید و آن را سه بار مرطوب کنید.
• مایع را در ظرف توزین بریزید. نوک سرسمپلر را به امتداد دیواره داخلی ظرف بکشید تا تمام مایع موجود در سرسمپلر تخلیه شود .

• وزن را در جدول یادداشت کنید.
• با استفاده از همان سرسمپلر، مراحل 3 تا 4 را حداقل 4 بار تکرار کنید. پس از هر بار خواندن ترازو را صفر کنید.
• سرسمپلر را خارج کنید و سرسمپلر جدید را بردارید.
• مراحل بالا را برای حجم دوم تکرار کنید.

5.  تجزیه و تحلیل داده ها

1. اعداد بدست آمده از ترازو (mg) را با استفاده از ضریب Z و طبق فرمول زیر به حجم (μl) تبدیل کنید:

که در آن

V_i = حجم واحد بر حسب میکرولیتر

m_i = وزن واحد بر حسب میلی گرم

Z = ضریب Z
 

۲. میانگین حجم را برای هر حجم مورد تست و هر کانال محاسبه کنید:

ῡ = حجم متوسط

n = تعداد توزین ها

۳.  صحت (خطای سیستماتیک) را بر حسب درصد محاسبه کنید:

e_s = خطای سیستماتیک بر حسب درصد

V_s  = حجم آزمون انتخاب شده

۴. دقت (خطای تصادفی) را بر حسب درصد محاسبه کنید:

 s_r =  تکرارپذیری انحراف استاندارد

 CV = ضریب تغییرات بر حسب درصد

صحت و دقت محاسبه شده را با صحت و دقت ذکر شده توسط شرکت سازنده میکروپپیت مقایسه کنید. اگر مقادیر محاسبه شده مطابق با مشخصات نباشد، میکروپیپت نیاز به کالیبراسیون دارد. در غیر اینصورت، می توان از آن استفاده کرد.

استاندارد ISO 8655 حدود دقت و صحت را به صورت مقادیر مطلق و نسبی بیان کرده است. مقادیر برای میکروپیپت های جابجایی هوای تک کاناله و حجم ثابت مشخص شده است. در مورد میکروپیپت های حجم متغیر، حجم اسمی، حداکثر حجم قابل انتخاب است. محدوده میکرولیتری حجم اسمی برای هر حجم قابل انتخاب در محدوده حجم اعمال می شود. برای مثال، برای یک میکرویپت 100-10 میکرولیتری، حداکثر محدده مجاز صحت (خطای سیستماتیک) 0.8 میکرولیتر و حداکثر حد مجاز دقت (خطای تصادفی) 0.3 میکرولیتر است. برای میکروپیپت های چند کاناله، این مقادیر بیشتر از دو برابر می شود.

توجه: کالیبراسیون میکروپیپت های الکترونیکی راحت است و اکثرا با وارد کردن حجم مورد نظر و حجم واقعی که اندازه گیری کرده اید و سپس استفاده از گزینه کالیبراسیون امکان پذیر است.

فاکتور  Z

معادله مرجع محاسبه فاکتور Z بصورت زیر می باشد:

Z = [1/(PW-PA)] [1-(PA/PB)]

که در آن  P_A= چگالی هوا در t°C

P_W = چگالی مایع مورد تست در t°C

P = چگالی وزنه های تعادل. برای PB از 8 گرم بر سی سی استفاده کنید.

مقادیر ضریب تبدیل Z (μL/mg) بعنوان تابعی از دما و فشار برای آب مقطر بصورت زیر می باشد.

منبع :

Guide To Pipetting (Third Edition), Gilson, 2018, https://www.gilson.com/pub/media/docs/GuideToPipettingE.pdf

https://www.integra-biosciences.com/global/en/calibration-check-how-calculate-accuracy-and-precision-pipette