میکروپیپت، پایپتینگ و اصطلاحات

برای کسب نتایج دقیق و کنترل شده در حوزه تحقیقاتی و بالینی، نیاز به پاپتینگ دقیق محلول ها با فرآیندهای قابل تکرار و نتایج قابل تأیید می باشد که میکروپیپت ها این امر را امکان پذیر کرده اند. میکروپیپت ها اجزای اساسی آزمایش ها بوده و در همه آزمایشگاه ها وجود دارند. این ابزارها وسیله ای برای انتقال حجم دقیق و مشخص محلول ها بوده و در انواع و حجم های مختلف موجود می باشد.در این مقاله اصطلاحات رایجی که مربوط به میکروپپیت و پایپتینگ است مورد بررسی قرار می گیرد.

بالشتک هوا (Air Cushion)

بالشتک هوا که ” هوای مرده” نیز نامیده می شود، حجمی از هواست که در میکروپیپت های جابجایی هوا بین پیستون و نمونه داخل سرسمپلر قرار دارد.

میکروپیپت جابجایی هوا (Air displacement pipette)

در میکروپیپت های جابجایی هوا، بین پیستون و نمونه داخل سرسمپلر، یک بالشتک هوا یا ” هوای مرده”، قرار می گیرد. در این نوع میکروپیپت ، تیپ بصورت یکبار مصرف مورد استفاده قرار می گیرند. کاربرد این نوع میکروپیپت ها بسیار متداول بوده و بسیاری از میکروپیپت هایی که در آزمایشگاه ها مورد استفاده قرار می گیرند، از این نوع هستند. برای اطلاعات بیشتر اینجا کلیک کنید.

میکروپیپت جابجایی مثبت (Positive displacement pipette)

در این نوع میکروپیپت ها، بین پیستون و نمونه داخل سرسمپلر، تماس مستقیم وجود دارد. مقدار مایع کشیده شده، به ابعاد سیلندر یا لوله مویین و فاصله حرکت پیستون بستگی دارد و تیپ استفاده شده هم شامل سیلندر/یا لوله مویین و هم پیستون است که بصورت یکبار مصرف مورد استفاده قرار می گیرد. برای اطلاعات بیشتر اینجا کلیک کنید.

صحت (Accuracy)

صحت، یک اصطلاح کیفی است که به میزان نزدیک بودن نتایج یک کمیت اندازه گیری شده به مقدار واقعی اشاره می کند. یعنی هر چقدر میانگین نتایج بدست آمده به مقدار واقعی نزدیک باشد، صحت بیشتر خواهد بود. منظور از مقدار واقعی، مقدار استاندارد یا رفرنس (در اینجا مرکز هدف)  است. در شکل زیر، هر کدام از نقاط نشان داده شده، نتایج بدست آمده را نشان می دهد. هر نقطه ای که از هدف فاصله کمتری داشته باشد، از صحت بیشتری برخوردار است.

دقت (precision)

دقت اصطلاحی است که به نزدیک بودن نتایج مربوط به مجموعه‌ای از اندازه‌گیری‌ها، اشاره دارد، خواه این مقادیر واقعیت را نشان بدهد یا خیر. یعنی، هرچه نتایج به دست آمده نسبت به هم تفاوت کمتری داشته باشند، دقت بیشتر است و دوری یا نزدیکی آنها به هدف اهمیتی ندارد. در شکل زیر، نقاط نشان داده شده به یکدیگر نزدیک می باشند که منشا دهنده دقت بالاست، در حالیکه از هدف دور هستند.  

شکل شماره 1، مجموعه داده‌هایی با دقت و صحت بالا را نشان می‌دهد. در این حالت، مقادیر علاوه بر اینکه با مقدار واقعی منطبق هستند، نسبت به یکدیگر نیز در فاصله کمی قرار دارند.

در شکل شماره 2، نتایج دارای صحت بسیار پایین است، درحالیکه دقت آن بسیار بالاست است. یعنی میانگین فاصله نقاط نسبت به یکدیگر بسیار کم است، در حالیکه که نسبت به هدف بسیار زیاد است. بنابراین اختلاف زیادی را با مقدار واقعی نشان می دهد.

در شکل شماره 3، نتایج دارای صحت خوبی است، اما دقت کافی را ندارد. یعنی میانگین نتایج بدست آمده با مقدار واقعی انطباق دارد، ولی فاصله داده‌ها از یکدیگر زیاد است.

 در شکل شماره 4، نتایج هم دارای صحت پایین و هم دقت پایین هستند. به عبارت دیگر، هم میانگین داده‌ها با مقدار واقعی فاصله زیادی دارد و هم فاصله داده‌ها از یکدیگر زیاد است.

در حال ایده آل، هر ابزاری باید صحت و دقت بالایی را نشان دهد. در واقع، هنگامی که دقت و صحت بالا در کنار هم قرار بگیرند، نتایج اندازه‌گیری، تکرارپذیر و نزدیک به مقدار واقعی خواهد بود. برای مطالعه راهکارهای افزایش صحت و دقت اینجا کلیک کنید.

الیکوت کردن (Aliquot)

اصطلاحی است که به چند نمونه با حجم معین که از یک محلول یا مخلوط استوک همگن بصورت متوالی برداشته می شوند، اشاره دارد. الیکوت کردن به معنای برداشتن حجم های معین متوالی از یک محلول با هدف ذخیره سازی یا کاربردهای دیگر اطلاق می شود.  در شکل زیر فرض کنید که الیکوت هایی با حجم 100 میکرولیتر از حجم اولیه 1000 میکرولیتری برداشته شده و در لوله های کوچکتر ریخته می شود. 

  

توزیع کننده یا دیسپنسر (Dispenser)

وسیله ای برای برداشت و ریختن حجم های از پیش تعیین شده مایع از یک منبع یا مخزن می باشد. منبع ممکن است متصل به دیسپنر باشد یا از آن جدا باشد. از دیسپنر می توان برای الیکوت کردن نیز استفاده کرد.

خطای تصادفی (Random Error)

  خطای تصادفی در پایپتینگ جزئی از خطای اندازه گیری است که مقادیر آن بصورت غیرقابل پیش بینی در اندازه گیری های تکراری تغییر می کند. یا به عبارت دیگر، خطای تصادفی برابر است با خطا منهای خطای سیستماتیک.  بعضی اوقات مقدار بدست آمده از مقدار واقعی بیشتر و بعضی اوقات کمتر است و هیچ گونه پیش بینی نسبت به جهت و الگوی این خطا نمی توانیم داشته باشیم. از آنجایی که در شرایط واقعی، فقط تعداد محدودی اندازه گیری می تواند انجام شود، تنها می توان تخمینی از خطای تصادفی را بدست آورد.  خطای تصادفی منبع مشخصی ندارد و حذف کردن این خطا امکان پذیر نیست. اما می توان با کنترل دقیق و طراحی آزمایش آن را به حداقل رساند. شرایط محیطی مانند دما، فشار، رطوبت، خواص الکتریکی همگی عواملی هستند که سبب خطای تصادفی می شوند.

به عنوان مثال ، فرض کنید میزان حجم مشخص شده روی میکروپیپت 82 میکرولیتر تنظیم شده است. در حجم برداری های مکرر، مشاهده می شود که میکروپیپت، حجم های مختلفی را بر میدارد، بعنوان مثال بار اول،80 میکرولیتر، بار دوم 79 میکرولیتر، بار سوم 81 میکرولیتر و …. . بنابراین اگر با تکرار حجم برداری ها، میکروپیپت مقادیر مختلفی از مایع را با یک حجم تعیین شده بکشد، در این حالت، با یک خطای تصادفی روبرو هستیم. در صورتیکه میکروپیپت دارای خطای سیستماتیک نیز باشد، از میزان کلی خطای اندازه گیری کم می شود تا میزان خطای تصادفی بدست آید.

خطای سیستماتیک (Systematic Error)

خطای سیستماتیک در پایپتینگ جزء خطای اندازه گیری است که در اندازه گیری های تکراری ثابت می ماند یا به صورت قابل پیش بینی تغییر می کند. در واقع این نوع خطا، تقریبا از یک عامل ثابت ناشی شود. میزان خطای سیستماتیک برابر است با خطا منهای خطای تصادفی.  مانند مقدار حجم واقعی (True value)، خطای سیستماتیک و علل آن را نمی توان به طور کامل شناخت. این نوع خطا، سبب انحراف یک سویه (bias) در نتایج اندازه گیری می شود و با مشاهده دقیق، ثبت نتایج تعمیر و کالیبراسیون درست دستگاه و آموزش اشخاص درگیر آنالیز، قابل حذف شدن است. یک ویژگی مهم خطای سیستماتیک ثابت بودن مقدار نسبی آن است.

در میکروپیپت، خطای سیستماتیک، میزان انحراف میانگین حجم اندازه گیری شده از حجم تنظیم شده روی میکروپیپت است. به عنوان مثال ، فرض کنید میزان حجم مشخص شده روی میکروپیپت 82 میکرولیتر تنظیم شده است. در حجم برداری های مکرر، میکروپیپت حجم مشخص شده را بر میدارد، اما از طریق روش ها و منابع دیگر ما مطمئن هستیم که میزان حجم برداشته شده 80 میکرولیتر( ونه ۸۲ میکرولیتر) است. بنابراین خطای سیستماتیک 2 میکرولیتر است. اگر با تکرار حجم برداری ها،  باز هم میکروپیپت ما میزان 80 میکرولیتر را حجم برداری کند، در این حالت، با یک خطای سیستماتیک روبرو هستیم.

عملیات خوب آزمایشگاهی (Good Laboratory Practice)

عملیات خوب آزمایشگاهی (GLP) به فرآیند سازمانی و شرایطی اطلاق می شود که تحت آن مطالعات آزمایشگاهی برنامه ریزی، انجام، نظارت، ثبت و گزارش می شوند.

اندازه گیری (Measurand)

به مقدار حجم خاصی که برای اندازه گیری در میکروپیپت در نظر گرفته شده است، اشاره دارد. مشخصات یک اندازه گیری ممکن است نیاز به ارائه توضیحاتی در مورد کمیت هایی مانند زمان، دما و فشار داشته باشد.

مقدار اسمی (Nominal Value)

مقدار گرد شده یا تقریبی معین شده برای اندازه گیری توسط یک میکروپیپت. بعنوان مثال حجم 100 میکرولیتر تنظیم شده بر روی میکروپیپت.

تکرارپذیری (Repeatability)

تکرارپذیری به دقت اندازه گیری تحت مجموعه ای از شرایط یکسان اندازه گیری ها اطلاق می شود. شرایط تکرارپذیری عبارتند از:

• روش اندازه گیری یکسان،
• کاربر یا ناظر یکسان،
• ابزار اندازه گیری یکسان، که در شرایط یکسان استفاده می شود،
• مکان یکسان،
• تکرار در یک دوره زمانی کوتاه مدت.

تکرارپذیری (نتایج اندازه گیری ها) (Reproducibility)

دقت اندازه گیری تحت شرایط تکرارپذیری اندازه گیری.

نمونه (Sample)

محلولی که در تست های آزمایشگاهی با میکروپیپت مورد بررسی قرار می گیرد.

حجم باقیمانده (Sample Carryover)

مقداری از نمونه که پس از ریختن نمونه در سرسمپلر باقی می ماند و ممکن است بر نمونه های بعدی تأثیر بگذارد. مقدار حجم باقیمانده در میکروپیپت های جابجایی مثبت کمتر از میکروپپیت های جابجایی هوا است.

مقدار حجم واقعی (True value)

مقدار واقعی مقداری است که با یک اندازه گیری کامل و درست به دست می آید.

محدوده کاری (Working range)

 محدوده کل حجم و دما و همچنین شرایط محیطی که عملکرد دستگاه برای آنها توصیف شده است و دارای یک مقدار حداکثر و یک مقدار حداقل می باشد. در هنگام کار با میکروپیپت، از تعریف پارامترهای خارج از محدوده های توصیه شده کاری باید اجتناب کرد. بعنوان مثال در شکل زیر حداقل حجم کاری 10 میکرولیتر و حداکثر حجم کاری ، 100 میکرولیتر است. خارج از این محدوده، صحت و دقت و کارکرد میکروپیپت تعریف نشده است.

روش حجم برداری استاندارد یا فوروارد (forward pipetting)

روش استاندارد حجم‌برداری با سمپلر است که با سمپلرهای جابجایی هوا و سمپلرهای جابجایی مثبت بکار می رود. در این حالت دکمه حجم برداری سمپلر تا توقف اول ( برابر با حجم تعریف شده ) فشار داده می شود و سپس سرسمپلر وارد نمونه محلول شده و حجم مشخص شده کشیده می شود و در نهایت با فشار دادن مجدد آن تا توقف اول محلول تخلیه می شود. برای مطالعه بیشتر اینجا کلیک کنید.

روش حجم برداری معکوس (Reverse pipetting)

این روش فقط در مورد سمپلرهای جابجایی هوا بکار می رود و بیشتر مراحل آن شبیه روش استاندارد می باشد. کاربرد آن بیشتر برای برداشتن مایعات ویسکوز و فرار و یا محلول های دارای حباب هوا، جهت جبران خطاهای حجم‌برداری است. در این حالت دکمه حجم برداری سمپلر تا توقف دوم ( بیشتر از حجم تعریف شده ) فشار داده می شود و سپس سرسمپلر وارد نمونه محلول شده و رها می شود. در این حالت حجم مایع کشیده شده بیشتر از حجم تنظیم شده می باشد. در نهایت با فشار دادن مجدد آن تا توقف اول محلول به میزان حجم تنظیم شده ریخته میشود. در این حالت ممکن است مقداری محلول درون سرسمپلر باقی بماند که یا دور ریخته می شود یا به ظرف اصلی برگردانده می شود. برای مطالعه بیشتر اینجا کلیک کنید.

عملکرد دمیدن (Blow out)

این عملکرد برای تخلیه کامل محلول باقیمانده در سرسمپلر می باشد که با فشار دادن دکمه حجم برداری تا توقف دوم انجام می گیرد. در میکروپیپت های الکترونیک، روش کار ممکن است متفاوت باشد.

آسپیراسیون (Aspiration)

به فرو بردن سرسمپلر در نمونه و کشیدن محلول اطلاق می شود، بطوری که در این حالت با رها کردن دکمه حجم برداری، پیستون به آرامی به حالت استراحت بر می گردد.

دیسپنس (Dispense)

به تخلیه محلول موجود در سرسمپلر اطلاق می شود که با فشار دادن دکمه حجم برداری تا توقف اول یا دوم انجام می شود.

اجکشن (Eject )

به جدا کردن سرسمپلر از سمپلر  بدون تماس دست با سرسمپلر اشاره دارد که با فشار دادن دکمه اجکت سمپلر امکانپذیر است.

منبع

Guide To Pipetting (Third Edition), Gilson, 2018, https://www.gilson.com/pub/media/docs/GuideToPipettingE.pdf

برای مطالعه عوامل موثر در افزایش صحت و دقت میکروپیپت اینجا کلیک کنید.