محققان زیست پزشکی در تلاش هستند تا نتایج بهینه و قابل اعتمادی را از آزمایشات تشخیصی، تحقیقاتی و توسعه ای در آزمایشگاه ها بدست آورند. از آنجاکه میکروپیپت ها متداول ترین ابزارهایی هستند که در آزمایشگاه مورد استفاده قرار می گیرند، بنابراین صحت و دقت (برای آشنایی با مفهوم صحت و دقت اینجا کلیک کنید) نتایج آزمایشات انجام گرفته نیز به عملکرد صحیح آنها وابسته است. به همین دلیل دانش فنی و عملیاتی میکروپیپتینگ برای محققین، تکنسین ها و دانشجویان جهت کسب نتایج دقیق آزمایشگاهی در علوم زیست پزشکی و سایر رشته های مرتبط ضروری است. علاوه بر نگهداری و ارزیابی های کیفی مناسب، رعایت دستورالعمل های صحیح پیپتنیگ، می تواند تکرار پذیری و صحت آزمایشات را به مقدار قابل توجهی افزایش دهد و منجر به دستیابی به شیوه های خوب آزمایشگاهی (GLPs) شود. تعدادی از عوامل تکنیکی و محیطی وجود دارند که بر دقت و صحت حجم برداری تاثیر می گذارند که در ادامه مورد بحث قرار می گیرند.
تکنیک مناسبی را برای پیپتینگ انتخاب کنید
تکنیک‌های حجم برداری به دو نوع اصلی تقسیم می‌شوند: پیپتینگ معمول و پیپتینگ معکوس. برای تمام نمونه ها باید از روش معمول (روش استاندارد یا روش فوروارد) استفاده شود و تنها برای نمونه های دارای چسبندگی، ویسکوزیته و فراریت زیاد از روش معکوس استفاده می شود. بدیهی است که اگر روش معکوس برای نمونه های مانند سرم استفاده شود، مقدار بیشتری حجم برداشته می شود. همچنین اگر از روش معمول برای برداشتن نمونه های ویسکوز استفاده شود، مقدار کمتری از حجم مورد نظر برداشته می شود. پیپتینگ معمول، دقت و صحت بهتری را نسبت به حالت معکوس برای همه مایعات به جز مایعات چسبناک و ویسکوز و یا فرار دارد.
در هر دو روش، اولین گام، تنظیم میکرومتر در حجم مورد نیاز بر اساس پروتکل سنجش است. برای افزایش دقت و صحت باید از تنظیم میکروپیپت درحجم های کمتر از 10 درصد حجم حداکثر میکروپیپت خودداری کرده و برای حجم های پایین تر، از میکروپیپت های مناسب استفاده شود. در مرحله دوم، یک تیپ یکبار مصرف مناسب توسط میکروپیپت برداشته می شود.
در روش پیپتینگ معمول، برای برداشت محلول، دکمه حجم برداری به آرامی تا ایستگاه اول فشار داده میشود. اینکار در حالتی انجام می شود که تیپ خارج از محلول قرار دارد تا هوای جابه‌جا شده باعث ایجاد حباب در محلول نشود. سپس تیپ با زاویه 90 درجه در داخل محلول قرار می گیرد و سپس دکمه حجم برداری به آرامی رها می شود تا پیستون به سمت عقب رفته و محلول وارد تیپ شود. اینکار به آرامی صورت می گیرد تا از کشیدن هوا به داخل تیپ جلوگیری شود. همچنین بهتر است، بعد از یک ثانیه تیپ را از نمونه بیرون آورد، این کار باعث میشود که حرکت مایع در سر سمپلر کامل شود. در صورتیکه تیپ سریع از محلول خارج شود، ممکن است مقدار نمونه برداشتی کم تر از حجم مورد نظر باشد. در نهایت، برای ریختن محلول، دکمه حجم برداری به آرامی تا ایستگاه اول فشار داده می شود تا محلول در لوله مقصد ریخته شود. فشار دکمه حجم برداری تا ایستگاه دوم باعث خروج کل محلول باقیمانده از تیپ می شود. این روش میکروپیپتینگ به عنوان روش پیپتینگ معمول نامیده می شود.
در روش حجم برداری معکوس، پس از تنظیم میکرومتر در حجم مورد نظر و برداشتن تیپ، دکمه حجم برداری تا ایستگاه دوم فشار داده میشود. اینکار در حالتی انجام می شود که تیپ خارج از محلول قرار دارد تا باعث ایجاد حباب در محلول نشود. سپس تیپ در داخل محلول قرار می گیرد و دکمه حجم برداری به آرامی رها می شود تا پیستون به سمت عقب رفته و محلول وارد تیپ شود. اینکار به آرامی صورت می گیرد تا از کشیدن هوا به داخل تیپ جلوگیری شود. در نهایت، برای ریختن محلول، دکمه حجم برداری تا ایستگاه اول فشار داده می شود تا محلول در لوله مقصد ریخته شود. سپس محلول باقیمانده در داخل تیپ با فشردن دکمه حجم برداری تا ایستگاه دوم، دور ریخته می شود. این روش حجم برداری به عنوان روش حجم برداری معکوس نامیده می شود.
از تیپ مناسب استفاده کنید
استفاده از تیپ استاندارد و مناسب، صحت و تکرار پذیری را افزایش می دهد. تا حد امکان از تیپ های مورد توصیه شرکت سازنده میکروپیپت استفاده کنید. مارکهای جایگزین در صورتی قابل قبول هستند که عملکرد درست آنها با مدل میکروپپیت شما ثابت شده باشد. تیپ هایی که ناسازگار هستند، می توانند منجر به عدم دقت یا صحت یا هر دو شود. تیپ های دارای کیفیت خوب، خلا خوبی را برای کشیدن و ریختن مایع ایجاد کرده و خالی از عیوب قالب گیری هستند و بنابراین میزان خطا را در حد استاندارد پایین می آورند. در بازار تیپ های غیراستاندارد زیادی وجود دارد که حتی شاید ارزان قیمت هم باشند، اما ممکن است بصورت محکم با میکروپیپت شما متصل نشده و باعث کشیدن هوا یا نشت مایع درهنگام کار شوند که منجر به برداشت و ریختن حجم های نادرست می گردد. از طرف دیگر استفاده از مواد نامرغوب برای ساختن تیپ می تواند باعث شود که نمونه بصورت کامل از داخل آن تخلیه نشده و بدلیل چسبندگی مایع به بدنه تیپ، همواره مقداری از نمونه در داخل آن باقی بماند که باز هم منجر به ایجاد نتایج نادرست می گردد. از این رو بهتر است قبل از استفاده از یک تیپ مشخص، ابتدا از کیفیت و قابلیت اتصال محکم آن با میکروپیپت خود اطمینان حاصل کنید و یا از توصیه های شرکت های سازنده و توزیع کننده در این زمینه بهره ببرید.
قبل از حجم برداری، تیپ را مرطوب کنید
قبل از حجم برداری، تیپ را مرطوب کنید(pre-wettting). به این منظور، حداقل 3 بار، مقداری از مایع را آسپیره کرده و کاملاً خارج کنید. عدم مرطوب کردن تیپ، باعث افزایش تبخیر در فضای هوای تیپ می شود که می تواند باعث کاهش قابل توجه حجم ریخته شده شود. مرطوب کردن تیپ، رطوبت داخل آن را افزایش می دهد و در نتیجه تبخیر کاهش می یابد. همچنین مرطوب کردن تیپ قبل از حجم برداری، به خنثی کردن اثرات موئینگی کمک می کند و دمای هوای داخل تیپ را با دمای نمونه متعادل می کند. اینکار همچنین به طور چشمگیری دقت پیپتینگ را، به خصوص برای حجم های بسیار پایین، بهبود می بخشد.
از زاویه غوطه وری و عمق غوطه وری مناسب استفاده کنید
برای افزایش دقت، تیپ را بصورت عمودی (با زاویه تقریباً 90 درجه) در محلول غوطه ور کنید و از کشیدن هوا به داخل تیپ خودداری کنید. نزدیک شدن به زوایای بین 45 تا 60 درجه، به طور قابل توجهی بر دقت پیپتینگ تأثیر می گذارد. عمق غوطه ور شدن تیپ نیز بسیار مهم است، هر چه تیپ، عمیق تر در مایع غوطه ور شود، احتمال چسبیدن مایع اضافی به قسمت بیرونی تیپ بیشتر می شود. این امر می تواند منجر به آسپیراسیون بیشتر از حجم مورد نظر شود و همچنین اثرات نامطلوبی را بر نتایج، به خصوص در هنگام کار با حجم های بسیار کوچک داشته باشد. در حالی که فرو بردن تیپ در نزدیکی سطح مایع می تواند منجر به آسپیراسیون حباب های ریز هوا به داخل تیپ و در نتیجه برداشت حجم نادرست شود. در حالت ایده‌آل، برای حجم های بزرگ تیپ به اندازه ۶-۵ میلی متر و برای حجم های کوچک باید 2 تا 3 میلی‌متر در داخل محلول قرار داده شود. هر چند استثناهایی در این مورد وجود دارد. در حالت معکوس، اغلب منجر به کار با حجم های بیشتری می شود.
میکروپیپت را بصورت مستقیم از محلول بیرون بکشید
هنگام آسپیراسیون، میکروپیپت را به صورت عمودی نگه دارید و میکروپیپت را بصورت مستقیم از محلول بیرون بکشید. این تکنیک به ویژه هنگام کار با حجم های کوچک (کمتر از 50 میکرولیتر) مهم است. نگه داشتن پیپت بصورت زاویه دار در حین خارج شدن از مایع، حجم آسپیره شده را تغییر می دهد. تماس تیپ با کناره های ظرف نیز باعث جذب محلول از تیپ به ظرف به دلیل خاصیت مویینگی و کاهش حجم محلول داخل آن می شود.
هنگام ریختن مایع، دقت و زاویه کافی را داشته باشید
در حین ریختن مایع، باید تیپ را نسبت به دیواره ظرف یا لوله با زاویه 45 درجه قرار داده و نمونه را بریزید و سپس نوک تیپ را از دیواره به سمت بالا بکشید تا باقیمانده مایع چسبیده به تیپ به ظرف منتقل شود. محلول های آبی (غیر ویسکوز) را می توان بر روی سطح یا داخل مایع دیسپنس کرد.
قبل و بعد از حجم برداری، تیپ را بررسی کنید
پس از توزیع و قبل از رها کردن پیستون، مایع باقیمانده در تیپ را با لمس نوک آن به کناره های ظرف خالی کنید. کشش سطحی، به بیرون کشیدن مایع باقی مانده از تیپ کمک می کند.
سرعت پیپتینگ خود را یکنواخت کنید
از فشار و سرعت ثابت برای فشار دادن دکمه حجم برداری و حرکت پیستون استفاده کنید. سرعت یکنواخت پیپتینگ نیز به طور قابل توجهی دقت را بهبود می بخشد. پیستون را به آرامی فشار دهید تا در اولین توقف با نیرویی سبک و ثابت در حالت استراحت قرار گیرد. تیپ را غوطه ور کنید، سپس پیستون را با سرعت ثابت رها کنید. آسپیراسیون سریع یا “نامنظم” ممکن است منجر به ایجاد آئروسل ها، آلودگی شفت پیپت، پاشیدن مایع، و از دست دادن کارایی و حجم نمونه شود. کسب نتایج صحیح به یکنواختی سرعت بستگی دارد. اقدامات تکراری نتایج قابل تکرار را ایجاد می کند.
پس از آسپیراسیون مکث کنید
پس از آسپیراسیون و قبل از خارج کردن تیپ از مایع، یک ثانیه مکث کنید. این مکث را تا حد امکان یکنواخت کنید. پس از توقف پیستون، برای مدت کوتاهی مایع به داخل تیپ جریان می‌یابد. در همان زمان، تبخیر در تیپ رخ می دهد. مکث به طور یکنواخت این دو اثر را متعادل می کند و آسپیراسیون صحیح را تضمین می کند.
از تغییرات دمایی اجتناب کنید
دمای مناسب برای میکروپیپتینگ °C 21.5 (°C ±1 ) است و نمونه ها باید با دمای محیطی که در آن کار می کنید، برابر باشد. به این منظور، نمونه ها باید به مدت 20 دقیقه در دمای محیط قرار گیرند. هر گونه تغییر دمای قابل توجه یا ناگهانی در نمونه ها یا میکروپیپت ها ممکن است دقت را کاهش دهد. پیپتینگ در دمای ثابت، دقت و صحت میکروپیپت را بهبود می بخشد. نکته مهم این است که دفع گرما از دستها در طی پیپتنیگ های طولانی مدت ممکن است باعث انبساط هوا در داخل میکروپیپت و کسب نتایج نادرست شود. برای جلوگیری از اینکار، باید بین مراحل مختلف کاری ، بجای نگهداشتن میکروپیپت در دست، آن را در پایه خود قرار داد. از دست زدن به پیپت و نوک تا حد ممکن اجتناب کنید. از لمس تیپ و ظروفی که برای پیپتینگ از آنها استفاده کنید اجتناب کنید. گرمای بدن که در حین جابجایی منتقل می شود، تعادل دما را بر هم می زند و منجر به تغییرات در حجم برداشته شده و ریخته شده می شود.
ارگونومی مناسب را در نظر بگیرید
رعایت شیوه های مناسب ارگونومی، دقت و عملکرد پیپتینگ را افزایش می دهد. خستگی دست و بدن، به خصوص در هنگام توزیع مقادیر کم و تعداد زیاد نمونه، ممکن است باعث ایجاد خطا در هنگام پیپتینگ شود. با قرار گرفتن بدن در وضعیت مناسب، گرفتن میکروپیپت در دست به نحوی که دست بصورت قلاب برای میکروپپیت عمل کرده و گرفتن آن را راحت تر کند، استراحت 3 تا 5 دقیقه ای بین مراحل طولانی پیپتینگ، استفاده از صندلی آزمایشگاهی چرخدار و قابل تنظیم برای راحتی دسترسی به رک ها، لوله های نمونه، سطل آشغال و سازماندهی مناسب میز کار قبل از شروع پیپتینگ، می توان از خستگی و آسیب های ناشی از پیپتینگ جلوگیری کرد
به نگهداری و سرویس دوره ای میکروپیپت اهمیت دهید
نگهداری مناسب و بررسی دوره ای میکروپیپت ها برای حفظ دقت و ثبات نتایج ضروری است. لازم است که کنترل کیفی میکروپیپت 3 الی 4 بار در سال انجام شود. اینکار با بررسی دقت و صحت عملکرد میکروپپیت به دو طریق وزن سنجی و رنگ سنجی قابل انجام است. بعد از ارزیابی کیفی، در صورتی که نتایج خوب نباشد، باید کالیبراسیون میکروپپیپ انجام گیرد. میکروپیپت را می توان باز و تمیز کرده و سپس در صورت نیاز کالیبراسیون را انجام داد. انجام کالیبراسیون پس از تمیز کردن میکروپیپت ضروری است.
برخی از مواد شیمیایی مانند حلال‌های آلی بر بخش‌های خاصی از میکروپیپت تأثیر می‌گذارند. اگر از میکروپیپت برای پیپتاژ حلال‌های آلی، اسیدها و قلیاها استفاده میشود، هر هفته باید اورینگ ها، پیستون و فنرهای پیستون را بررسی و روغن کاری کرد. برای محافظت از میکروپیپت در برابر آلودگی با نمونه و یا جلوگیری از ورود ذرات معلق در هوا، ورود مایعات یا ذرات خارجی می توان از تیپ فیلتردار استفاده کرد.
نتیجه گیری
برای کسب نتایج دقیق، تسلط بر مهارت های خوب پیپتینگ در همه زمینه های علوم زیست پزشکی ضروری است. علاوه بر این، برای دستیابی به نتایج آزمایشگاهی بهینه، داشتن اطلاعات جامع در مورد میکروپیپت ها و روش های عملیاتی آن برای کاربران بسیار مهم است. محققان، تکنسین ها و دانشجویان قبل از شروع فعالیت های آزمایشگاهی، باید آموزش های عملی مناسب وجامع را در این زمینه گذرانده و همچنین باید اطلاعات کافی را در مورد دستورالعمل های عملیاتی و فنی میکروپیپت های مورد استفاده خود کسب کنند.
منابع
1. Pushparaj PN. Revisiting the Micropipetting Techniques in Biomedical Sciences: A Fundamental Prerequisite in Good Laboratory Practice. Bioinformation. 2020 Jan 1;16(1):8-12.
2. Artel ( 2011, October 04), 10 Tips to Improve Your Pipetting Technique, https://www.labmanager.com/laboratory-technology/10-tips-to-improve-your-pipetting-technique-18116
برای مطالعه چگونگی تاثیر سرعت و زمان بندی در پیپتینگ اینجا کلیک کنید.
کارشناسی ارشد ژنتیک انسانی و علاقمند به نویسندگی و ترجمه در حوزه علوم آزمایشگاهی، ژنتیک، علوم سلولی-مولکولی و تجهیزات آزمایشگاهی. مترجم زبان انگلیسی از سال ۱۳۹۰