عوامل مختلفی شامل فشار بخار و دما می توانند بر دقت کار با میکروپیپت تاثیر بگذارند. همه عواملی که در ادامه در مورد آنها صحبت می شود، مانند مرطوب کردن سرسمپلر، میزان رطوبت نسبی، فشار مایع، دمای محیط و اختلاف دما، همگی بر میزان فشار بخار محلول درون سرسمپلر و میکروپپیت در میکروپپیت های بالشتک هوا و بر نهایت بر میزان صحت و دقت میکروپیپتینگ تاثیر می گذارد.
مرطوب کردن سرسمپلر
مرطوب کردن سرسمپلر (پر کردن و تخلیه سرسمپلر با مایع) هنگام پیپت کردن آب یا محلول های آبی، سطح اشباع بخار آب را در سرسمپلر و داخل میکروپیپت افزایش می دهد [۱]. اگر حجم برداری با میکروپپیت بدون مرطوب کردن سرسمپلر آغاز شود، در یک سری اندازه گیری تا رسیدن به مقدار تعادل فشار بخار، مقدار حجم های توزیع شده به تدریج افزایش می یابد. این افزایش به دلیل افزایش رطوبت نسبی در سرسمپلر و داخل میکروپیپت با انجام مراحل پیپتینگ پشت سرهم می باشد. برای افزایش رطوبت داخلی میکروپیپت، در شروع کار با آن، ابتدا باید سرسمپلر چندین بار مرطوب شود. بعد از عوض کردن سرسمپلر، در کار با محلول های آبی، کافی است سرسمپلر جدید را فقط یکبار مرطوب کنید تا میزان تبخیر به حداقل برسد.
رطوبت نسبی
با وجود مرطوب شدن سرسمپلر، حجم پیپت شده تا حد مشخصی به رطوبت هوای محیط نیز بستگی دارد [۱]. اگر رطوبت نسبی هوای محیط از ۸۰ درصد به ۲۰ درصد کاهش یابد، حجم توزیع شده بصورت زیر کاهش می یابد.
- 2.1 تا 3.5 درصد برای میکروپیپت های ۱۰ میکرولیتری
- 0.3 تا 0.6 درصد برای میکروپیپت های ۲۰۰ میکرولیتری با سرسمپلر زرد (حجم مرده کم)
- 0.9 تا 1.2 درصد برای میکروپیپت های ۲۰۰ میکرولیتری با سرسمپلر آبی (حجم مرده بالا)
فشار بخار
هنگام استفاده از میکروپیپت های بالشتک هوا (میکروپیپت های رایج، برای آشنایی با انواع میکروپیپت ها به این لینک مراجعه شود)، مایعات با فشار بخار بالا، مانند حلال ها را نمی توان با دقت و صحت مشخص شده برای آب مقطر توزیع کرد. هنگام کار با چنین مایعاتی، تأثیرات تبخیر به دلایل زیر قابل توجه است: فشار بخار بیشتر از آب است و حجم هوای موجود در سرسمپلر در ابتدا کاملاً غیراشباع است [۱]. برای اطمینان از بالاترین سطح اشباع فاز بخار ممکن در داخل میکروپیپت، سرسمپلر باید به مدت بسیار طولانی ( یک دقیقه یا بیشتر) مرطوب شود. با این وجود، حجم پیپت شده باز هم همیشه کمتر از حجم اسمی خواهد بود.
دمای سیستم، اختلاف دما و گرادیان دما
تا زمانی که اختلاف دمایی در سیستم هوای داخل میکروپیپت-نمونه-محیط وجود نداشته باشد، مقدار حجم توزیع شده عملاً مستقل از دمای سیستم است [۱]. از سوی دیگر، به دلیل ضریب حرارتی بالای انبساط هوا، هنگامی که سرسمپلر در مایع غوطه ور است، تغییرات جزئی دمای بالشتک هوا ممکن است منجر به خطاهای نسبتاً بزرگی شود. چنین تغییرات دمایی، از اختلاف دمایی بین میکروپیپت، نمونه و هوای محیط ناشی می شود که در ادامه هر کدام توضیح داده می شود.
اگر میکروپیپت، گرمتر از مایع و هوای محیط باشد، هوای وارد شده در هنگام آسپیراسیون مایع، از طریق تماس با میکروپیپت گرمتر شده و باعث انبساط آن می شود. هنگامی که میکروپیپت در مایع غوطه ور می شود، مایع درون سرسمپلر جابجا می شود و در نهایت حجم آسپیره شده و حجم ریخته شده نیز کاهش می یابد. برعکس، با یک گرادیان دمایی مخالف، حجم آسپیره شده و حجم ریخته شده نیز افزایش می یابد. از آنجایی که هر گونه افزایش در دمای میکروپیپت ممکن است منجر به کاهش شدید حجم توزیع شده شود، باید با طراحی مناسب میکروپیپت از انتقال گرما از دست کاربر به پیستون میکروپیپت جلوگیری کرد. در میکروپپیت های جدید، این مشکل کم و بیش با ایجاد فاصله فضایی کافی بین پیستون و دسته و همچنین تعبیه محافظ حرارتی یا عایق حل شده است (شکل ۱).
اگر دمای محیط افزایش یابد، در حالی که دمای میکروپیپت و مایع ثابت بماند، حجم پیپت شده افزایش می یابد. با این حال، این تأثیر بسیار کمتر از تاثیرات حاصل از تغییر دمای میکروپیپت است.
اگر دمای نمونه افزایش یابد، در حالی که دمای میکروپیپت و دمای اتاق ثابت بماند، حجم پیپت شده افزایش می یابد (شکل ۲).
می توان انتظار داشت که بالشتک هوا در حین آسپیراسیون گرمتر شود و منجر به انبساط و جابجایی بخشی از نمونه شود و تا زمانی که مرطوب شدن سرسمپلر انجام نشود، این فرض درست است. در حالی که سرسمپلر از قبل مرطوب شده، منجر به افزایش حجم توزیع شده می شود، برای حالتی که سرسمپلر از قبل مرطوب نشده است قضیه برعکس است.
برای جلوگیری از تغییرات دمایی در بالشتک هوا در حین پیپت کردن، دمای میکروپیپت، نمونه و دمای محیط باید یکسان باشد. هرچه اختلاف دما کمتر باشد، نتایج دقیق تر خواهد بود. اما، حالت ایده‌آل که در آن دمای تمام اجزای حجم برداری در آزمایشگاه یکسان است، استثنا است، به ویژه زمانی که با نمونه های سرد یا مایعات بدنی که در دمای بدن هستند، کار می شود. توصیه می شود این خطای حاصله که اغلب نیز اجتناب ناپذیر است، با استفاده از اندازه گیری های کنترلی و در نظر گرفتن نتایج آن در آزمایشات خود محاسبه کنید.
فشار هوا و سطح دریا
میانگین فشار هوای یک مکان به ارتفاع آن از سطح دریا بستگی دارد. اگر یک میکروپیپت به عنوان مثال در هامبورگ تنظیم شده اما در مونیخ استفاده می شود، سطوح مختلف دریا منجر به اختلاف میانگین سالانه در فشار هوا به اندازه ۶۳- میلی بار می شود [1]. برای مثال برای یک میکروپیپت ۱۰۰۰ میکرولیتری، این امر منجر به کاهش حجم ۰.۰۶۴٪ می شود. برای یک میکروپیپت ۵۰ میکرولیتری، تفاوت ۰.۱۴-٪ است. اگر فشار هوا به دلیل تغییرات عمده در آب و هوا ۲۵ ± میلی بار نوسان داشته باشد، این امر منجر به اختلاف بیشتر ۰.۰۲۴ ± درصد برای میکروپیپت ۱۰۰۰ میکرولیتر و ۰.۰۵۶ ± درصد برای میکرو پیپت ۵۰ میکرولیتری می شود (شکل ۳). بنابراین هنگام بررسی (کالیبره کردن) میکروپیپت ها، مهم است که نوسانات فشار را در نظر بگیرید.
منابع:
1.Lochner K H, Ballweg, T, Fahrenkrog, H-H: Untersuchungen zur Messgenauigkeit von Kolbenhubpipetten mit Luftpolster. Lab Med. 1996; 20, No. 7/8:. 430–440
2.USERGUIDE No. 21 I June 2015 ,Influence of physical parameters on the dispensed volume of air-cushion pipette, Eppendorf, https://handling-solutions.eppendorf.com/fileadmin/Community/Calibration/USERGUIDE_21_GB_V4_final_1_.pdf
کارشناسی ارشد ژنتیک انسانی و علاقمند به نویسندگی و ترجمه در حوزه علوم آزمایشگاهی، ژنتیک، علوم سلولی-مولکولی و تجهیزات آزمایشگاهی. مترجم زبان انگلیسی از سال ۱۳۹۰