نحوه کار با میکروپیپت (سمپلر)

میکروپیپت یا سمپلر ضروری ترین ابزار مورد استفاده در آزمایشگاه بیولوژی مولکولی است. از میکروپیپت برای اندازه گیری مقادیر بسیار کم مایع در آزمایشگاه استفاده می شود و اینکار توسط اتصال سرسمپلرهای پلاستیکی یکبار مصرف به میکروپپیت انجام می شود. برای کار با میکروپیپت، کاربر باید با چگونگی تنظیم درست حجم آن، نحوه برداشتن سرسمپلر، برداشتن و ریختن نمونه و نحوه رها کردن سرسمپلر آشنا باشد.

انواع میکروپپیت (سمپلر) بر اساس حجم

میکروپیپت در اندازه های استاندارد مختلف موجود بوده و رایج ترین آنها حجمی بین ۰.۱ میکرولیتر تا ۱۰۰۰میکرولیتر را اندازه گیری می کنند، یعنی حجمی بین ۰.۰۰۰۱ میلی لیتر تا ۱میلی لیتر. چون ۱۰۰۰میلی لیتر برابر با ۱ لیتر است، ۱۰۰۰میکرولیتر نیز برابر با ۱میلی لیتر خواهد بود. هر میکروپیپت فقط در محدوده خاص حجم خود به طور موثر کار می کند و تغییر حجم در میکروپیپت های با حجم مختلف، مشابه است. برای جلوگیری از سردرگمی کاربران، سازندگان میکروپیپت ها، بر روی آنها حداکثر حجمی که می تواند به طور دقیق حجم برداری کند را می نویسند. مثلا سمپلر ۱۰۰۰ نشان دهنده این است که سمپلر قادر است حجم حداکثر ۱۰۰۰ میکرولیتر را با دقت حجم برداری کند. برخی نیز حداقل حجم را نیز اضافه کرده و در واقع محدوده حجم را مشخص می کنند. به عنوان مثال میکروپپیت ۱۰۰۰-۱۰۰ میکرولیتر نشان دهنده حداقل و حداکثر حجمی است که میکروپپیت با دقت موثر آن را حجم برداری می کند. با این حال، به دلیل وجود استانداردهای مشابه در بین تولیدکنندگان میکروپپیت، حداقل حجم ها برای هر میکروپیپت یکسان است، مگر اینکه خلاف آن ذکر شده باشد. بعنوان مثال وقتی از میکروپپیت ۱۰۰۰میکرولیتری صحبت می شود، محدوده حجم ۱۰۰۰-۱۰۰ میکرولیتری مد نظر است. محدوده انواع سرسمپلرها در ذیل قابل مشاهده است.

میکروپپیت ۲ میکرولیتری : ۲ – ۰.۱ میکرولیتر

میکروپپیت ۱۰ میکرولیتری : ۱۰ – ۱ میکرولیتر

میکروپپیت ۲۰ میکرولیتری: ۲۰- ۲ میکرولیتر

میکروپپیت ۲۰۰۰ میکرولیتری: ۲۰۰- ۲۰میکرولیتر

میکروپپیت ۱۰۰۰ میکرولیتری: ۱۰۰۰- ۱۰۰میکرولیتر

میکروپیپت با حجم ۲۰۰ میکرولیتر را در نظر بگیرید. این میکروپیپت حجمی بین ۲۰ تا ۲۰۰ میکرولیتر را اندازه گیری می کند. حداقل محدوده دقیق بیشتر انواع میکروپیپت ها، ۱۰ درصد از  میزان حجم حداکثر خواهد بود. یعنی برای این میکروپپیت ۲۰۰ میکرولیتری، میزان حجم حداقل ۱۰ درصد ۲۰۰ میکرولیتر یعنی ۲۰میکرولیتر خواهد بود. در صورت تردید در این زمینه، دفترچه راهنما یا وب سایت شرکت سازنده می تواند محدوده دقیقی را که یک میکروپیپت حجم برداری می کند نشان دهد.

کدام میکروپیپت با چه حجمی برای کار شما مناسب است ؟

همیشه کوچکترین میکروپیپت را انتخاب کنید که حجم مورد نظر شما را با بیشترین دقت جابجا کند. استفاده از میکروپیپت های بزرگ برای حجم های کوچک، دقت را کاهش می دهد. مثلا برای حجم ۲۰۰میکرولیتری، از میکروپپیت ۱۰۰۰میکرولیتری استفاده نکنید. هر چند این حجم در محدوده میکروپپیت ۱۰۰۰ قرار دارد، ولی دقت میکروپپیت ۲۰۰برای کشیدن آن بیشتر است. در کارهای آزمایشگاهی حساس سعی کنید تا جای ممکن این موضوع را در نظر داشته باشید. مثلا برای جابجایی ۱۵۶میکرولیتر از دو نوع میکروپپیت ۲۰۰و ۱۰ استفاده کنید، به این صورت که ۱۵۰میکرولیتر را با میکروپپیت ۲۰۰و ۶ میکرولیتر باقیمانده را با میکروپپیت ۱۰حجم برداری کنید. اینکار باعث افزایش دقت در کارهای حساس به مقادیر کم می شود.

فرآیند کار با میکروپپیت

به طور کلی یک فرآیند ساده کار با میکروپپیت می تواند به صورت مراحل زیر انجام شود که در ادامه هر کدام از آنها به تفصیل توضیح داده می شوند.

۱. اتصال سرسمپلر مناسب به میکروپپیت با فشار جزئی روی دهانه سرسمپلر

۲. تنظیم حجم مورد نظر با چرخاندن پیچ تنظیم حجم

۳. فشردن دکمه حجم برداری قبل از فرو بردن سرسمپلر در مایع

۴. فرو بردن سرسمپلر در داخل مایع و رها کردن تدریجی دکمه حجم برداری جهت کشیدن مایع

۵. قرار دادن نوک سرسمپلر در ظرف مورد نظر و فشردن دکمه حجم برداری جهت ریختن مایع

۶. خارج کردن (اجکت) سرسمپلر

نحوه برداشتن سرسمپلر توسط میکروپپیت

طراحی میکروپیپت به نحوی است که در تماس مستقیم با نمونه قرار نگرفته و برای برداشت نمونه توسط آن از سرسمپلر استفاده می شود. اگر به انتهای میکروپیپت های مختلف نگاه کرده باشید، باید متوجه شده باشید که قطر و محیط یکسانی ندارد. به همین دلیل، در میکروپیپت های مختلف از سرسمپلرهای با اندازه های مختلف استفاده می شود. سه نوع سرسمپلر با اندازه حجمی مختلف وجود دارد که می توانند رنگ های متفاوتی داشته باشند. سرسمپلرهای سفید مناسب میکروپپیت های ۱۰ و ۲۰میکرولیتری هستند، سرسمپلرهای زرد مناسب میکروپپیت های ۲۰۰میکرولیتری هستند و سرسمپلرهای آبی مناسب میکروپپیت های ۱۰۰۰میکرولیتری هستند. برای آشنایی بیشتر با انواع سرسمپلر اینجا کلیک کنید.

برای برداشتن سرسمپلر توسط میکروپیپت، ابتدا باید سرسمپلر را در جعبه سرسمپلر بچینید، سپس انتهای میکروپیپت را با فشار جزئی بر دهانه سرسمپلر فشار دهید تا سرسمپلر به میکروپپیت متصل شود. فشار نباید به حدی زیاد باشد که باعث آسیب به نوک سرسمپلر شده و یا در اثر اتصال محکم به میکروپپیت، نتواند با فشار اجکتور از میکروپپیت رها شود. همچنین، اتصال بین میکروپپیت و سرسمپلر باید به حدی محکم باشد که از ورود هوا جلوگیری شود، در غیر این صورت مقدار محلول کشیده نادرست خواهد بود. به این منظور باید از سرسمپلرهای استاندارد و یا سرسمپلرهایی که شرکت سازنده توصیه کرده است، استفاده شود. اگر سرسمپلر افتاد، آن را دور انداخته و سرسمپلر جدید بردارید. اینکار به ویژه برای آزمایشاتی که نیاز به استریل سازی دارند جهت جلوگیری از الودگی بسیار حائز اهمیت است.

نکته:  از تماس نوک سرسمپلر با اشیا و سایر وسایل (از جمله دستکش، لباس، مو، پوست، میزکار) اجتناب کنید.

نکته: هنگام انجام PCR، کار با  RNA یا کار با نمونه های استریل، از سرسمپلرهای فیلتردار و یا استریل شده توسط اتوکلاو استفاده کنید. جعبه سرسمپلر را ببندید تا استرلیته حفظ شود.

نحوه تنظیم حجم

روی بدنه میکروپیپت یک صفحه کوچک با سه عدد وجود دارد. این اعداد که از بالا به پایین خوانده می شوند، به کاربر نشان می دهند که میکروپیپت در حال حاضر در چه حجمی تنظیم شده است. در شکل زیر مثالی از حجم ها برای هر کدام از میکروپیپت ها آمده است.

به صفحه جلوی میکروپیپت نگاه کنید، پنجره ای با سه رقم در داخل آن خواهید دید که نشان دهنده حجم تنظیمی است. برای تنظیم حجم، میزان حجم را با پیچاندن پیچ تنظیم در جهت عقربه های ساعت افزایش و با پیچاندن آن در خلاف جهت عقربه های ساعت کاهش دهید و اعداد را روی حجم مورد نظر خود تنظیم کنید. به این منظور محدوده حجمی میکروپپیت را در نظر بگیرید.

معمولا، حداکثر حجمی که می توان در هر میکروپیپت حجم برداری کرد، بر روی میکروپپیت درج می شود. حجم بیش از این مقادیر، میکروپیپت را از کالیبراسیون خارج می کند.

میکروپپیت ۱۰ میکرولیتری: حداکثر حجم ۱۰ میکرولیتر و دقت بین ۱ تا ۱۰ میکرولیتر. اعداد روی میکروپیپت (معمولا سیاه-سیاه-قرمز) به صورت XX.X µl خوانده می شود. تغییر رنگ نشان دهنده موقعیت نقطه اعشار است.

میکروپپیت ۲۰ میکرولیتری: حداکثر حجم ۲۰ میکرولیتر و دقت بین ۲ تا ۲۰میکرولیتر. اعداد روی میکروپیپت (معمولا سیاه-سیاه-قرمز) به صورت XX.X µl خوانده می شود. تغییر رنگ نشان دهنده موقعیت نقطه اعشار است.

میکروپپیت ۲۰۰میکرولیتری: حداکثر حجم ۲۰۰میکرولیتر و دقت بین ۲۰تا ۲۰۰ میکرولیتر. اعداد روی میکروپیپت تک رنگ و مشکی است و به صورت XX.X µl خوانده می شود.

میکروپپیت ۱۰۰۰میکرولیتری: حداکثر حجم ۱۰۰۰میکرولیتر(یک میلی لیتری) و دقت بین ۲۰۰تا ۱۰۰۰میکرولیتر. اعداد روی میکروپیپت (معمولا قرمز -سیاه- سیاه) به صورت XXX.X ml خوانده می شود.

برای یادگیری نحوه خواندن حجم وقت بگذارید تا با تنظیم حجم در خارج از محدوده میکروپپیت، باعث آسیب به آن نشوید.

نحوه برداشتن نمونه

با نگه داشتن میکروپیپت در دست، انگشت شست آزاد است تا در بالای میکروپیپت یعنی دکمه حجم برداری متصل به پیستون قرار گیرد. با فشار دادن و رها کردن این دکمه، نمونه مایع به داخل سرسمپلر کشیده و خارج می شود. حجم محلول برداشته شده با مقدار فشار دادن پیستون نسبت مستقیم دارد. حجم های بزرگتر به فشار بیشتری نیاز دارند، در حالیکه حجم های کوچک نیازمند فشار کمتر هستند.

هنگامی که سرسمپلر مناسب برداشته شد و تنظیم حجم انجام شد، میکروپپیت آماده حجم برداری نمونه است. با استفاده از انگشت شست، به آرامی پیستون را فشار دهید تا مقداری مقاومت را احساس کنید. این نقطه به ایستگاه توقف اول یا همان توقف نرم معروف است. از آنجایی که نقطه توقف اول بستگی به حجمی دارد که در حال انتقال است، فاصله ای که باید پیستون را فشار دهید تا به نقطه مقاومت اولیه برسید بسته به حجمی که پیپت می شود تغییر می کند. در حالی که پیستون را در نقطه تنظیم حجم و در پایین نگه داشته اید، سرسمپلر را در داخل محلول قرار دهید. توجه کنید که سرسمپلر را بعد از فشار دادن پیستون وارد محلول کنید، در غیر اینصورت فشار دادن پیستون باعث ایجاد حباب در داخل محلول خواهد شد. سرسمپلر باید به حدی در داخل محلول غوطه ور شود که انتهای آن را بپوشاند (حدود ۴-۳ میلی متر)، از فرو بردن زیاد سرسمپلر به داخل محلول اجتناب کنید، زیرا باعث چسیبیدن محلول به سطح بیرونی سرسمپلر و ایجاد خطا می شود. به آرامی پیستون را رها کنید تا مایع به داخل سرسمپلر جریان پیدا کند، رها کردن سریع پیستون باعث می شود حجمی که نمونه برداری می کنید نادرست باشد، حرکت آهسته پیستون به دقیق بودن حجم برداشته شده کمک می کند. در عین حال مطمئن شوید که سرسمپلر همچنان در داخل محلول غوطه ور است، زیرا گاهی اوقات با کشیدن محلول توسط میکروپپیت و کم شدن ارتفاع آن در مخزن شاید نیاز به تغییر موقعیت سرسمپلر در داخل محلول باشد. در نهایت محلول داخل سرسمپلر را با چشم بررسی کنید تا از صحت و عدم وجود هوا در داخل آن مطمئن شوید.

 نکته: اگر محلولی که پیپت می‌کنید ویسکوز است، قبل از اینکه سرسمپلر را از محلول خارج کنید اجازه دهید تا حجم نهایی پر شود و از وجود حباب در سرسمپلر که منجر به حجم نادرست می‌شود، جلوگیری شود. در کار با محلول های ویسکوز به دلیل سرعت جریان پایین محلول زمان بیشتری برای کشیدن مورد نظر نیاز است. برای آشنایی با نحوه پیپتینگ محلول های ویسکوز این مقاله را مطالعه کنید.

نحوه ریختن نمونه

سرسمپلر را در ظرفی که می خواهید محلول را در آن بریزید قرار دهید. برای خارج کردن محلول، به آرامی پیستون را فشار دهید تا زمانی که به نقطه نرم یا اولین توقف برسید. به دلیل کشش سطحی، ممکن است مقداری از نمونه در داخل سرسمپلر باقی بماند. نقطه توقف دوم برای تخلیه کامل محلول ها از سرسمپلر استفاده می شود. برای ریختن مایع باقیمانده، پیستون را کمی بیشتر و فراتر از مقاومت اولیه فشار دهید تا زمانی که دیگر پیستون حرکت نکند و به نقطه انتهایی برسد. این نقطه به عنوان توقف سخت یا ایستگاه توقف دوم شناخته می شود. فشار دادن پیستون تا ایستگاه دوم، باعث خروج هوا از طریق سرسمپلر و امکان خروج محلول باقیمانده از سرسمپلر می شود که به آن عملکرد دمیدن یا blow-out گفته می شود. در نهایت، بدون رها کردن پیستون، سرسمپلر را بیرون بکشید.

نکات

جدا کردن سرسمپلر

هنگامی که حجم برداری به پایان رسید، باید سرسمپلر را دور بیندازید. یک شاسی بزرگ در بالای میکروپیپت و در کنار پیستون وجود دارد که درموقعیت انگشت شست می تواند قرار گیرد و به آن اجکتور گفته می شود(شماره ۱ در شکل پایین). برای خارج کردن سرسمپلر، این شاسی را فشار دهید. در صورتی که این شاسی در میکروپپیت شما موجود نبوده و یا کار نمی کند، سرسمپلر را از قسمت بالا، جایی که مایعات با آن تماس نداشتند، گرفته و آن را خارج کنید. سرسمپلر های خود را در کیسه زباله قابل اتوکلاو یا جعبه دفع سرسمپلر اختصاص داده شده بیندازید. باکتری های باقیمانده در سرسمپلر باید از بین بروند، زیرا می توانند خطرات زیستی را برای افراد دیگر در آزمایشگاه یا حتی افراد خارج از آزمایشگاه ایجاد کنند.

پیپتینگ حجم های کوچک

در مورد پیپتینگ حجم های کوچک، به خصوص محدوده حجمی ۱۰-۱ میکرولیتر، به دلیل اینکه حجم بسیار پایین بوده و از دست رفتن مقدار حجمی کوچک باعث اختلاف حجمی زیاد می شود، باید دقت بیشتری را هم در کشیدن و هم ریختن مایعات صرف کرد. برای ریختن، با دقت محلول را روی دیواره داخلی لوله تخلیه کرده و با چشم آن را دنبال کنید، قبل از رها کردن پیستون، سرسمپلر را با دقت بیرون بکشید. برای آشنایی بیشتر با نحوه پیپتینگ نمونه های با حجم کم اینجا کلیک کنید.

اگر حجم های اندک از یک محلول را به یک حجم بزرگتر اضافه می کنید ( مثلا در هنگام رقیق کردن در یک حلال)، پس از بیرون ریختن قطره، سرسمپلر را با مایع حلال چند بار پیپتاژ کنید تا مطمئن شوید که تمام مایع داخل سرسمپر وارد حلال شده است. اگر حجم های اندک از یک محلول را به یک حجم کوچک اضافه می کنید، بعد از ریختن محلول باید سانتریفیوژ کرده و سپس لوله را ورتکس کنید تا واکنشگرها به خوبی مخلوط شوند.

بررسی کالیبراسیون میکروپپیت (سمپلر)

سعی کنید برنامه ای را برای بررسی کنترل کیفیت و بررسی کالیبراسیون میکروپیپت خود داشته باشید. همانطور که گفته شد یک میکرولیتر آب مقطر حجمی برابر با وزن یک میلی گرم در شرایط استاندارد دارد. بر اساس حجم میکروپپیت، چند نقطه حجمی را وزن گیری کنید. میکروپیپت هایی که خطای بیش از ۵ درصد دارند باید دوباره کالیبره شوند. برای آشنایی با این فرآیند به اینجا مراجعه کنید.  

تمرین پیپتینگ

بر خلاف تصور عموم، یادگیری نحوه استفاده از میکروپیپت می تواند سخت تر از آن چیزی باشد که به نظر می رسد. قبل از شروع آزمایشات خود، حداقل یک جلسه تمرین با میکروپیپت جدید به شدت توصیه می شود. با وزن کردن مقدار محلولی که پیپت می کنید می توانید دقت میکروپپیت خود را بررسی کنید و “تفاوت ایستگاه های توقف نرم و توقف سخت” را تمرین کنید. برای اینکار نیاز به میکروپیپت (بعنوان مثال میکروپپیت ۲۰۰ میکرولیتری)، جعبه سرسمپلر، یک ظرف کوچک آب، یک ظرف خالی برای پیپت کردن و یک ترازوی دیجیتال دارید.

ظرف خالی خود را روی ترازو دیجیتال قرار دهید و آن را صفر کنید. بعنوان مثال با استفاده از میکروپیپت ۲۰۰ میکرولیتری، می خواهیم ۱۵۰ میکرولیتر آب آب را حجم برداری کنیم. حجم میکروپپیت را روی ۱۵۰میکرولیتر تنظیم کنید. یک سرسمپلر بردارید و پیستون را تا اولین توقف فشار دهید، سرسمپلر را در آب فرو کنید و به آرامی پیستون را رها کنید. به آرامی نوک سرسمپلر را روی سطح داخلی ظرف روی ترازو دیجیتال قرار دهید. پیستون را تا ایستگاه دوم فشار دهید تا تمام آب خارج شود. وزن را یادداشت کنید. از آنجایی که آب دارای چگالی ۱ گرم در میلی لیتر است، حجم ۱۵۰میکرولیتر از آب، باید وزن ۱۵۰میلی گرم یا ( یا ۰.۱۵۰ گرم ) داشته باشد. نیازی به دور انداختن سرسمپلر نیست و برای باقی مراحل نیز از همین سرسمپلر استفاده کنید.

در مرحله بعدی، آب داخل ظرف را با یک دستمال حوله ای کاغذی تمیز کنید و دوباره ترازوی دیجیتال را صفر کنید. اینبار قصد داریم با استفاده از میکروپیپت ۲۰۰میکرولیتری، حجم ۲۵۰میکرولیتری از آب را وزن کنیم. خوب مسلما حجم ۲۰۰میکرولیتر خارج از محدوده میکروپپیت ۲۰۰میکرولیتری است، پس برای اینکار ما دو اندازه گیری را رابا حجم ۱۲۵میکرولیتر می توانیم انجام دهیم که مجموع آنها ۲۵۰ میکرولیتر می شود. حجم میکروپپیت را روی ۱۲۵میکرولیتر تنظیم کنید. یک سرسمپلر برداشته و حجم مورد نظر را برداشته و به روش بالا داخل ظرف بریزید. دوباره با حجم ۱۲۵میکرولیتری اینکار را انجام دهید و وزن مجموع را یادداشت کنید. بررسی کنید که آیا وزن بدست آمده نزدیک به 250 میلی گرم است یا نه.

در مرحله بعدی، دوباره آب داخل ظرف را با یک دستمال حوله ای کاغذی تمیز کنید و دوباره ترازوی دیجیتال را صفر کنید. اینبار قصد داریم با استفاده از میکروپیپت ۲۰۰ میکرولیتری، حجم ۳۷۵میکرولیتری از آب را وزن کنیم. خوب مسلما باز هم حجم ۳۷۵میکرولیتر خارج از محدوده میکروپپیت ۲۰۰ میکرولیتری است، پس برای اینکار ما دو اندازه گیری را را با دو حجم ۲۰۰ و ۱۷۵ میکرولیتری می توانیم انجام دهیم که مجموع آنها ۳۷۵میکرولیتر می شود. حجم میکروپپیت را روی ۲۰۰ میکرولیتر تنظیم کنید. یک سرسمپلر برداشته و حجم مورد نظر را برداشته و به روش بالا داخل ظرف بریزید. دوباره با حجم ۱۷۵میکرولیتری اینکار را انجام دهید و وزن مجموع را یادداشت کنید. بررسی کنید که آیا وزن بدست آمده نزدیک به ۳۷۵میلی گرم است یا نه.

منابع

https://research.mcdb.ucla.edu/Goldberg/HC70AL_Su14/pdf/How%20to%20Use%20a%20Micropipettor.pdf

https://genosensoreducation.com/tech-bulletin/2019/6/14/how-to-use-a-micropipette

https://www.hemocytometer.org/using-a-pipette/