آیا شما هم هنگام پیپت کردن محلول های ویسکوزی مانند گلیسرول انتهای سرسمپلر را می برید؟ اگر جز افرادی هستید که در آزمایشگاه اینکار را انجام می دهند، باید گفت که اینکار باعث کاهش دقت و صحت حجمی می شود (برای مطالعه بیشتر در مورد دقت و صحت اینجا کلیک کنید) و درواقع می توان گفت که این حالت هیچ فرقی با حالتی که مستقیماً گلیسرول را از بطری به داخل تیوب بریزید نمی کند. بنابراین، بهتر است در این زمینه روش خود را تغییر دهید تا نتایج پیپتینگ شما بهبود یافته و در هنگام کار با مایعات ویسکوز، نتایج قابل اعتمادتر و قابل تکرارتری را کسب نمایید. اگر دوست دارید در این زمینه اطلاعات بیشتری کسب کنید در این مقاله با ما همراه باشید. در این مقاله، چالش‌های موجود در پیپتینگ محلول های ویسکوز و راه های غلبه بر آنها مورد بررسی قرار می گیرد.
ویسکوزیته، معیار مقاومت مایع در برابر جریان است که می توان آن را هنگام پیپت کردن، با مشاهده سرعت یا کندی جریان مایع در هنگام آسپیراسیون و دیسپنس مشاهده کرد. ویسکوزیته را می توان به صورت ویسکوزیته دینامیکی یا ویسکوزیته سینماتیکی بیان کرد. در این مقاله تمرکز بر روی ویسکوزیته دینامیکی مایعات است، زیرا این نوع ویسکوزیته، حرکت مایع را توصیف می کند. درجه ویسکوزیته بر حسب میلی پاسکال در ثانیه (mPa*s) مشخص می شود. آب خالص و بسیاری از بافرهای آبی، ویسکوزیته پایینی دارند و به راحتی جریان پیدا می کنند. یک گروه از مایعات که در هنگام پیپت کردن نیاز به توجه ویژه دارند، مایعات ویسکوز هستند. این مایعات در آزمایشگاه، یا به شکل خالص یا به عنوان اجزای بافر استفاده می شوند. نمایندگان معروف و شناخته شده مایعات ویسکوز در آزمایشگاه های تحقیقاتی، گلیسرول، تریتون X-100 و Tween® 20 هستند. همچنین آزمایشگاه هایی که کنترل کیفیت مواد غذایی، لوازم آرایشی، دارویی و سایر محصولات مصرفی را انجام می دهند، نیز روزانه با محلول های ویسکوز سروکار دارند. عسل و پلی اتیلن گلیکول نیز بسیار ویسکوز بوده و جریان بسیار کندی دارند. مستر میکس ها نیز عمدتا ویسکوز هستند. در ادامه تاثیر انواع فاکتورهای مختلف بر پیپتینگ این نوع محلول ها بررسی می شود.
نوع میکروپیپت استفاده شده
میکروپیپت‌ها در همه آزمایشگاه‌ها موجود هستند و در این میان میکروپیپت‌های جابه‌جایی هوا متداول تر هستند (برای آشنایی با انواع میکروپپیت ها اینجا کلیک کنید). سازندگان و شرکت های کالیبراسیون میکروپیپت‌های جابجایی هوا، آنها را با استفاده از مایعات با ویسکوزیته پایین مانند آب مقطر، آزمایش و کالیبره می کنند. نمونه‌های مایع دارای ویسکوزیته حدود ۲۰۰mPa*s مانند گلیسرول ۸۵ درصد را می‌توان با استفاده از میکروپیپت های بالشتک هوا منتقل کرد. در صورت استفاده از تکنیک های خاص، مانند پیپتینگ معکوس، آسپیراسیون حباب های هوا یا باقی ماندن مایع در داخل سرسمپلر به حداقل رسیده و منجر به نتایج دقیق تر می شود. اما با این حال، این حداقل کاری است که می توان برای بهبود پیپتینگ مایعات ویسکوز انجام داد.
برای کشیدن مایعات ویسکوز با این نوع میکروپپیت ها، پیپتینگ استاندارد فوروارد توصیه نمی شود، زیرا اغلب حجمی از مایع در داخل سرسمپلر باقی می ماند که باعث کاهش حجم نهایی می شود. برای پیپت کردن مایعات ویسکوز توسط میکروپیپت جابجایی هوا، از روش پیپتینگ معکوس باید استفاده کرد. با پیپت کردن در حالت معکوس، میزان حجم برداشته شده ازمقدار مایع دیسپنس شده بیشتر خواهد بود، زیرا در موقع آسپیراسیون، پیستون تا ایستگاه دوم فشار داده می شود، ولی در موقع دیسپنس، پیستون تا اولین ایستگاه فشار داده می شود. اینکار باید بصورت آهسته و پیوسته انجام شود. خلاصه ای از این روش در ادامه آمده است. برای مطالعه بیشتر درمورد پیپتینگ معکوس به اینجا مراجعه کنید.
- اگر از میکروپیپت قابل تنظیم استفاده می کنید، آن را روی حجم دلخواه تنظیم کرده و سرسمپلر مناسب را بردارید.
- میکروپیپت را به صورت عمودی نگه داشته و پیستون را تا ایستگاه دوم بصورت کامل فشار دهید.
- سرسمپلر را در مایع فرو ببرید.
- در حالی که سرسمپلر در مایع غوطه ور است، پیستون را به آرامی تا نقطه انتهایی رها کنید.
- میکروپیپت را به آرامی از مایع خارج کنید و با فشار آهسته تا اولین توقف (از اولین توقف عبور نکنید) در ظرف مقصد دیسپنس کنید.
- میکروپیپت و سرسمپلر را به آرامی از ظرف مقصد خارج کنید. در این حالت باید مقدار کمی مایع در داخل سرسمپلر باقی مانده باشد.
- با فشار دادن پیستون تا ایستگاه دوم (عملکرد blowout) حجم باقیمانده را در یک ظرف جداگانه بریزید و سرسمپلر استفاده شده را خارج کنید.
هنگامی که ویسکوزیته افزایش می یابد، مشکلات نیز بیشتر می شود. انتقال محلول های دارای ویسکوزیته متوسط تا حدود ۱۰۰۰mPa*s با استفاده از میکروپیپت های بالشتک هوا دشوارتر است. به دلیل اصطکاک داخلی زیاد مولکول ها، مایعات ویسکوز، رفتار جریانی بسیار کندی دارند و پیپتینگ باید بسیار آهسته و با دقت انجام شود. تکنیک پیپتینگ معکوس، اغلب برای انتقال دقیق مایع کافی نیست و بسیاری از افراد برای دقت بیشتر، نمونه های خود را وزن می کنند. این استراتژی به معنای در نظر گرفتن چگالی مایع و همچنین شرایط آزمایشگاهی مانند رطوبت و دما برای محاسبه دقیق حجم مایع مورد نیاز بر اساس وزن است. بنابراین، ابزارهای پیپتینگ دیگری که اصطلاحاً به آنها میکروپپیت های جابجایی مثبت می گویند، در این زمینه توصیه می شود. این نوع میکروپپیت ها، یک سرسمپلر با پیستون یکپارچه، درست مانند سرنگ دارند. از این رو، در حالی که انتقال دقیق مایع انجام می شود، مایع را می توان به راحتی آسپیره و دیسپنس کرد. تکنیک خاصی هم در این زمینه لازم نیست. این نوع میکروپیپت‌ها دارای سرسمپلرهای اختصاصی هستند که دارای پیستونی است که در تماس مستقیم با نمونه است. در حین توزیع مایع، پیستون موجود با حرکت خود که در تماس با دیواره داخلی سرسمپلر است، تمام مایع موجود را تمیز کرده و بدون توجه به ویسکوزیته محلول، کل محلول را از سرسمپلر خارج می کند. مایعات ویسکوز خاصیت چسبندگی زیادی را به سطح داخلی سرسمپلر نشان می دهند، بنابراین میکروپیپت های جابجایی مثبت برای محلول های ویسکوز عملکرد بهتری را فراهم کرده و باعث افزایش دقت محلول ریخته شده می شوند.
با این وجود، ابزارهای جابجایی مثبت نیز برای محلول‌های بسیار ویسکوز مانند عسل مایع، کرم های پوست یا روغن‌های مکانیکی خاص توانمند نیستند. مایعات بسیار سختی از این دست، به ابزارهای ویژه دیگری نیاز دارند که از اصل جابجایی مثبت استفاده می کند، اما دارای طراحی بهینه برای کار با محلول های بسیار ویسکوز هستند. بعنوان مثال شرکت اپندورف در این زمینه ®ViscoTip را تولید کرده است.
نوع سرسمپلر مورد استفاده
وقتی سخن از سرسمپلر به میان می‌آید، پیدا کردن سرسمپلر مناسب برای کار با مایعات ویسکوز می‌تواند بسیار دشوار باشد. برخی کاربران، انتهای سرسمپلر را برای افزایش اندازه سوراخ آن با هدف بهبود پیپتینگ برش می دهند، اما وقتی انتهای سرسمپلر بریده می شود، ابعاد طراحی سرسمپلر تغییر کرده و منجر به آسپیره شدن حجم های نادرست می شود. یک گزینه بهتر، استفاده از سرسمپلرهای اختصاصی موجود در بازار است که به طور خاص برای انواع مایعات چالش برانگیز طراحی شده اند. می توان از سرسمپلرهای دهانه گشاد ( Wide bore pipette tip یا wide-orifice tip) برای پیپت کردن محلول های ویسکوز استفاده کرد. این نوع سرسمپلرها به مایعات غلیظ تر اجازه می دهد تا راحت تر جریان پیدا کنند. سرسمپلرهای دارای قدرت چسبندگی پایین (low retention pipette tip) نیز به این منظور می تواند مورد استفاده قرار گیرد ( برای مطالعه انواع سرسمپلر اینجا کلیک کنید). باید در نظر داشت که تغییر سرسمپلر ممکن است به نظر به بهبود پیپتینگ کمک کند، اما ممکن است تأثیرات نامطلوبی بر دقت داشته باشد. برای یافتن سرسمپلر مناسب برای پیپت کردن مایعات ویسکوز از راهنمای شرکت سازنده میکروپیپت استفاده کنید.
کنترل میکروپپیت، آسپیراسیون و دیسپنس
هنگام کار با مایعات ویسکوز، کنترل مناسب میکروپیپت به اندازه استفاده از میکروپیپت و سرسمپلر مناسب مهم است. هنگام پیپت کردن مایعات ویسکوز، مکث طولانی تری در طول آسپیراسیون و همچنین دیسپنس لازم است. برای اینکار، در ابتدا باید مدت مکث مناسب جهت بهترین نتیجه را تعیین کرده و هر بار آن را ثابت نگه داشت. برای تعیین اینکه آیا مکث پس از آسپیراسیون به اندازه کافی است یا نه، سرسمپلر پر شده را پس از خارج کردن از محلول بررسی کنید. اگر شکاف هوا در داخل سرسپملر ایجاد شد، یعنی مدت زمان مکث بیشتری لازم است. پس از دیسپنس مایع، نوک سرسمپلر را بررسی کنید. اگر قطره ای تشکیل شد، یعنی مدت زمان مکث طولانی تری لازم است.
باید بخاطر داشت که حرکات آهسته و پیوسته هنگام فشار دادن و رها کردن پیستون منجر به افزایش دقت و کیفیت می شود. اینکار باعث می شود تا از آسیب ناخواسته به میکروپیپت، شل شدن سرسمپلر، چسبیدن محلول اضافی در قسمت بیرونی سرسمپلر یا ریختن محلول از سرسمپلر به بیرون بدلیل تکان دادن آن جلوگیری شود. بنابراین انجام حرکات آهسته و پیوسته تأثیر زیادی بر دقت و صحت نتایج در کار با مایعات ویسکوز خواهد داشت.
عمق غوطه وری مناسب
عمق غوطه وری باید متناسب با حجم و سرسمپلر باشد. هر چه سرسمپلر و حجم آن کوچکتر باشد، عمق غوطه وری کمتر می شود.
اجتناب از ایجاد حباب هوا
برای رفع حباب های هوای ایجاد شده در محلول های ویسکوز زمان زیادی لازم است و وجود حباب می تواند دقت حجمی را نیز کاهش دهد. برای جلوگیری از ایجاد حباب هوا، از مخلوط کردن محلول های ویسکوز خودداری کنید و از شیکر یا سانتریفیوژ برای حذف حباب های موجود استفاده کنید.
تمرین، تمرین و باز هم تمرین
مانند تسلط بر هر مهارتی، پیپت کردن انواع مایعات نیازمند تمرین و ممارست است. کار با هر نوع میکروپیپت و سرسمپلر روش مخصوص به خود را خواهد داشت. تمرین با انواع مختلف میکروپیپت ها و سرسمپلرها باعث افزایش اعتماد به نفس کاربر و همچنین بهبود دقت و صحت می شود. می توان برنامه های آموزشی را برای کاربران جهت کار با مایعات ویسکوز نیز در نظر گرفت. گلیسرول، روغن های غذایی و حتی صابون ظرفشویی برای استفاده در حین تمرین عالی هستند، زیرا پیپت کردن این نوع مایعات چالش زا می باشد. به یاد داشته باشید، تمرین همراه با محاسبه بازخورد در مورد دقت و صحت، اعتماد به نفس را در کار با مایعات ویسکوز بهبود می بخشد. با استفاده از ابزار مناسب، تمرین کافی و کسب اطلاعات در مورد نوع مایع، می توان بر چالش های پیپتینگ مایعات ویسکوز پیروز شد. برای مطالعه در مورد محاسبه صحت و دقت اینجا کلیک کنید.
منابع
https://www.artel.co/pipetting-viscous-solutions/
https://accumaximum.com/tips_to_improve_pipetting/
کارشناسی ارشد ژنتیک انسانی و علاقمند به نویسندگی و ترجمه در حوزه علوم آزمایشگاهی، ژنتیک، علوم سلولی-مولکولی و تجهیزات آزمایشگاهی. مترجم زبان انگلیسی از سال ۱۳۹۰